牛奶中蛋白質的測定原理及其注意事項
摘要：本文主要針對應用凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質的原理及其具體的消化和蒸餾過程中分別應注意的幾大問題加以介紹，以期對從事蛋白質測定工作的檢測人員有一定的幫助。
關鍵詞：牛奶蛋白質 測定原理 注意事項
蛋白質對于人體具有構成體內原生質和修補身體組織，并制造酶和激素等生命基礎物質，調節(jié)生理機能的作用。蛋白質及其分解產物對食品的色、香、味和產品質量都有一定的影響。蛋白質的高低將直接決定食品的營養(yǎng)價值。牛奶作為人體*的蛋白質供給源，屬于*蛋白質，其中的8種人體必需氨基酸種類齊全，比例適當。其蛋白質含量達牛乳的3.4%左右，乳蛋白的消化吸收率一般為97%-98%，高于植物蛋白，而且消化速度又比肉、魚、蛋等動物性蛋白快。測定蛋白質的方法很多，目前zui基本和zui常用的方法是先測定總氮量，再乘以不同食品的蛋白質系數，即為食品中蛋白質的含量。測定總氮量的方法目前國家標準仍采用凱氏定氮法為法定的標準檢驗方法。凱氏定氮法有常量法、半微量法和微量法等。其測定原理相同，主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實驗規(guī)模小，實
0 引 言
驗費用低的優(yōu)點。但微量法的準確度和精密度比常量法要差一些。另外，還有雙縮脲法、紫外吸收光譜法、福林-酚試劑法、考馬斯亮藍染色法等，也常用于蛋白質含量的測定，由于方法簡單快速，多用于生產單位質量控制分析。近年來國外還推出了近紅外品質測試儀對蛋白質進行快速分析的方法。但凱氏定氮法正由于它的諸多優(yōu)點而仍然應用普遍。
1．測定原理
將含有蛋白質的待測樣品同濃硫酸一起加熱消化，使氮變成氨，同時形成氨鹽，在消化液中加入過量的堿,再加熱將氨蒸餾出來,并收集于硼酸溶液中，zui后用酸堿滴定法測定其總氮量。
1.1 消化
樣品中含氮有機物與濃硫酸和催化劑一起加熱消化.使蛋白質分解,分解的胺基氨與過量的硫酸結合生成硫酸胺留在溶液中，其主要反應式為：
RCH.NH2COOH+H2SO4 ->CO2+SO2+NH3+H2O
2NH3+H2SO4->（NH4）2SO4
另外，催化劑硫酸銅在有機物全部消化后，溶液顯清澈透明的藍綠色，可用它來指示消化終點。此外，硫酸銅還可用做下一步蒸餾時堿性反應的指示劑。 過氧化氫，為氧化劑，有助于有機物消化，同時可以消除消化過程中的氣泡現象。
1.2 蒸餾
消化終了后所有蛋白質的氨態(tài)氮都轉化成銨鹽形式，硫酸銨在堿性條件下進行蒸餾，將釋放出來的氨用硼酸溶液吸收，生成四硼酸氫銨．其反應式：
（NH4）2SO4+2NaOH ->Na2SO4+2NH3+2H2O
NH3+4H3BO3 ->NH4HB4O7+5H2O
1.3 滴定
用鹽酸標準溶液直接滴定產生的四硼酸氫銨，根據消耗鹽酸溶液的量計算樣品含氮量，然后換算成蛋白質含量。
NH4HB4O7+HCL+5H2O ->NH4CL+4H3BO3
2.試劑與儀器
2.1 儀器及用具
凱氏燒瓶（500ml） 容量瓶（100ml）錐形瓶 酸式滴定管（25ml或50ml）
上海沛歐SKD-08S2消化爐 上海沛歐 SKD-100,200,600定氮儀（或定氮蒸餾裝置）
2.2試劑
試劑要求均為分析純，所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制
濃硫酸 凱氏定氮催化劑過氧化氫溶液（體積分數為30%）
NaOH溶液：（C（NaOH）=400g/L稱取400gNaOH固體，用100ml除去CO2的蒸餾水溶解，待冷卻后移入試劑瓶內）
硼酸溶液：（C（H3BO3）為40g/L.稱取20g固體硼酸，溶解于500ml熱蒸餾水中，搖勻備用）
甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑： （用體積分數為95%乙醇，將溴甲酚綠與甲基紅分別以2g/L溶于95%乙醇溶液中，使用時按5：1的比例混合）
鹽酸標準溶液：（C（HCL）=0.1000mol/L）
3. 操作過程的注意事項
3.1 消化
3.1.1凱氏定氮法的誤差，主要因消化操作的條件而產生，因此要格外注意。
4。結束語
3.1.2量取的樣品倒入凱氏燒瓶時，不要將樣品粘在瓶頸上，以免加入消化液后試樣炭化粘在瓶頸上消化不*．消化過程中要逐漸升溫，當低溫加溫至出現帶有硫酸的白色氣體后，才可升溫使溶液沸騰，但應避免劇烈沸騰。
3.1.3消化過程中，消化液體積不可蒸至少于原來的三分之二，更不可蒸干，若硫酸損失過多，應酌量補加硫酸。若取樣量較大，如干待測樣超過5克，可按每克試樣5毫升的比例增加硫酸用量。
3.1.4當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%雙氧水2-3毫升后再繼續(xù)加熱消化。但在消化后期不得加入，因此消化液中還原物質（如：碳）含量減少，氧化劑易造成氨進一步氧化為氮逸出，使測定結果偏低。
3.1.5消化液澄清后，必須繼續(xù)加熱沸騰三十分鐘，以提高氮的回收率，若催化劑中有硒存在，加熱時間過長也可能使氮素損失。一般情況下，純牛奶需消化4.5小時即可。
3.2蒸餾
3.2.1．消化液加蒸餾水稀釋后，應及時蒸餾，否則應保存消化液，臨用時再加蒸餾水稀釋．反應室加入堿液后，應立即蓋塞并加水封，注意各接頭處的密封情況，防止漏氣。
3.2.2 甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑必須于臨用前按比例混勻，其在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。
3.2.3．蒸餾時，加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外，還與消化液中的硫酸和硫酸銅作用．反應式：
2NaOH+H2SO4 ->Na2SO4+2H2O
2NaOH+CuSO4 ->Na2SO4+Cu（OH）2
Cu（OH）2 ->CuO +Cu（OH）2
若加入的氫氧化鈉不夠，則溶液呈藍色，不生成褐色的氫氧化銅沉淀．所以，加入的氫氧化鈉必須過量，并且動作還要迅速，以防止氨的流失。
3.2.4．蒸氣發(fā)生瓶內的水裝至三分之二體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶內的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，內加甲基橙指示劑數滴，水應呈橙紅色，如變黃時，應該補加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出，使結果偏大。
3.2.5．因蒸餾時反應至外層的氣壓大于反應室內的壓力，而反應室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸餾中不得停火斷氣，否則，會發(fā)生倒吸。停止蒸餾時，由于反應室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應室外層，所以，操作時，應先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分鐘后關掉熱源。蒸餾是否*，可用精密ＰＨ試紙測冷凝管口的冷凝液來測定，中性則說明已蒸餾*。
3.2.6 在鹽酸標準溶液的配制時，必須將基準無水碳酸鈉于270-300℃灼燒至恒重后稱取所須用量，否則也會影響蛋白質測定結果的準確性。
牛乳提供了人體必需的蛋白質，而提供準確可靠的蛋白質含量則是食品檢驗工作人員的必需技術，凱氏定氮法作為目前法定的國標方法與我們的工作密不可分，本文主要通過綜述凱氏定氮法操作的注意事項而提供給關注此檢測方法的從業(yè)人員一定的幫助，與筆者和讀者會有一定提高。
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